基因擴增PCR檢測技術(shù)能幫助檢疫人員快速發(fā)現(xiàn)該病毒。PCR實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域:試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染,進入各個工作區(qū)域須嚴格遵循單一方向進行,從試劑準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)單向流動。
基因擴增PCR的標本制備區(qū)進行臨床標本的保存,核酸提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。 要正確使用加樣器。
由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動??赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料,須有明確的樣本處理和滅活程序。
用過的加樣器吸頭須放入專門的消毒容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔,實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺,則須分別處理并作出記錄。 對實驗臺適當?shù)淖贤庹丈洌?54nm波長,與工作臺面近距離)適合于滅活去污染。
可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。 樣本處理對核酸擴增有很大影響,須使用有效的核酸提取方法,可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。
用于RNA擴增檢測樣本制備好以后,應(yīng)立即進行CDNA合成,因為cDNA鏈較RNA穩(wěn)定,保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要,應(yīng)在標本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。
CDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定,傾向于使用一步法:
即使用在擴增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉(zhuǎn)錄,其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。待測RNA的CDNA拷貝須保存在標本制備區(qū),不得在本區(qū)對樣本進行基因擴增PCR。
