PCR 技術(shù)自發(fā)明以來已經(jīng)三十多年，一直廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域，普通定性PCR在基礎(chǔ)研究中仍舊是不可或缺的環(huán)節(jié)。今天小寶來聊一聊定性PCR儀更為實驗人員關(guān)注的溫控性能和常見問題。
對普通PCR儀來說，溫度控制指標(biāo)主要是指溫度的準(zhǔn)確性、均一性、以及升降溫速度。
溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的失誤操作問題，對于PCR反應(yīng)而言更重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性。
溫度的均一性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的一致性。
寶予德Life Eco PCR基因擴增儀，采用專利的TAS技術(shù)，通過特殊的高分子材料處理有效的避免了熱傳導(dǎo)的邊緣效應(yīng)。
升降溫的速度是指在PCR不同反應(yīng)階段溫度升降的速度。顯然，更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)所需的時間，而且有效降低由于升降溫過程產(chǎn)生的非特異性結(jié)合、縮短了反應(yīng)的時間，能提高PCR反應(yīng)的特異性。
但是，值得注意得是儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因為樣品管與基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。
Life Eco具有兩種控溫模式：Block控溫模式、Tube控溫模式。在Block模式下，儀器會根據(jù)探測器直接探測的溫控模塊的溫度進(jìn)行控制，這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育，如連接、酶切、去磷酸化等。Tube模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由微計算機計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制。一般說來，Tube模式更為準(zhǔn)確，因為管內(nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。因此小寶建議在應(yīng)用LifeEco PCR基因擴增儀時采用Tube控溫模式。
1. 陰性對照和陽性對照都出現(xiàn)陽性擴增帶
原因
①陰性樣品和PCR 反應(yīng)試驗污染。
②電泳上樣時避免PCR 產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定。
解決方法
①更換全部試劑，必要時更換所有移液器。
②應(yīng)小心操作，或瓊脂糖凝膠加厚，增加每孔的容量，可避免加樣液的溢出。
2. 陽性對照呈陰性
原因
①陽性樣品或加入陽性模板失效。無論是組織還是血清，凍融1 次后病原數(shù)量明顯減少。
②加入試劑量不準(zhǔn)確或遺忘了某一成分。
解決方法
①將陽性對照樣品分成小包裝。每個包裝夠用1 次更好。
②仔細(xì)核對試驗記錄，校對移液器。
3. 出現(xiàn)非特異擴增帶
原因
①樣品模板量過多。
②引物或TaqDNA 聚合酶多。
③鎂離子濃度過高或退火溫度過低。
解決方法：
依據(jù)具體實驗的情況，分析上述可能出現(xiàn)的原因，采取相應(yīng)的措施。
4. 陽性對照擴增帶弱
原因
①電泳時瓊脂糖中EB含量少或長時間后再用已失效。
②擴增效率不高。
解決方法
①是將瓊脂糖凝膠放入含有EB 電泳液中再染30 min 后再觀察。
②檢測儀器是否正常工作。
③增加純化DNA 或cDNA 樣品的稀釋倍數(shù)。
彩蛋來了
擴增效率不高的原因
a.反應(yīng)體系問題，操作中加入緩沖液、TaqDNA 聚合酶、引物等不準(zhǔn)確，造成不能達(dá)到更佳反應(yīng)體系。
b.儀器不能正常工作。
c.樣品處理過程中殘留有較多PCR 反應(yīng)抑制物造成的。多數(shù)情況是由于操作者怕PCR 不出陽性，有意無意提高PCR 檢測樣品量造成的。
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