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技術文章

進階的PCR,了解一下

更新日期:2019年7月1日 大字 小字


導讀
盤點PCR技術

PCR技術是模擬體內DNA的天然復制過程,在體外擴增DNA分子的一種分子生物學技術,主要用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。

PCR分類

PCR技術自1983年Kary Mullis發(fā)明以來,在經典的梯度PCR基礎上,又拓展了新的PCR技術。不同PCR技術的涌入,急速壯大了PCR家族。



PCR分類

篇幅有限,先從入門級PCR涉及到的Hot start PCR(熱啟動PCR)、Long PCR(長片段PCR)、Touchdown PCR(降落PCR)開始講起。



熱啟動PCR

在模塊溫度到達設定的變性溫度之前,模塊內的樣品往往要一起經歷加熱的過程,此時Taq酶仍具有一定活性,部分的引物和模板會在酶的作用下進行非特異性的結合、延伸,消耗反應物, 導致特異性擴增減少。目前一般采用溫控系統(tǒng)或使用特殊Taq酶避免此現(xiàn)象的發(fā)生,稱之為熱啟動PCR。


Long PCR(長片段PCR)


 Long PCR(長片段PCR)則可以滿足較長片段的DNA片段的擴增需求,常用Taq酶和Pfu酶混合使用并配以特殊的緩沖液,避免錯誤的dNTP加入到片段中。在正常10-15個循環(huán)之后,每一個循環(huán)的延伸時間都要上一次循環(huán)的延伸時間多出10秒左右,以此配合完成正確的延伸。





Touchdown PCR(降落PCR)

由于影響PCR效率的因素有很多,比如引物、退火溫度,循環(huán)次數(shù)等,逐一驗證選擇最適條件會花費大量的時間及成本,因此,降落PCR是針對一系列不太的退火時間來考量的:退火溫度的起始值高于T值15℃,每一個(或n個)循環(huán)后比之前的循環(huán)的退火溫度都要低,直到溫度等于或低于T值,此后,在低溫環(huán)境下再進行幾個循環(huán),以此達到特異性擴增的目的。高溫環(huán)境能使部分特異性結合發(fā)生,再降溫,某些非特異性擴增已不具備優(yōu)勢,因此能夠高效擴增。



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